《食品科学》：北京三元食品股份有限公司陈历俊教授级高级工程师等：基于UP ...

康佳小青

母乳作为婴幼儿最优的营养来源，富含多种营养物质和生物活性成分，对婴儿生长发育和免疫功能具有不可替代的重要作用。除提供蛋白质、脂质、碳水化合物等主要营养成分外，母乳中还含有数以千计的小分子代谢物，包括氨基酸、脂肪酸、低聚糖、信号分子及微生物代谢产物等，这些成分协同影响婴儿的营养吸收、肠道菌群平衡和免疫系统发育。近年来，随着质谱技术的发展，代谢组学已成为全面分析母乳中小分子代谢物的重要工具，有助于揭示母体生理状态、遗传因素和环境暴露等对乳成分的影响，解析母乳成分与婴儿营养及发育之间的关系，从而为婴幼儿营养需求理解及配方乳粉的优化提供科学依据。
然而母乳成分的高度动态性和个体间的显著差异使得许多活性代谢物仍未被充分解析，亟需依靠高通量、广覆盖的代谢组学技术进行系统研究。液相色谱-质谱联用技术因其高灵敏度和高通量已成为母乳代谢组分析的主流方法。其中，超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOFMS）凭借其高分辨率、质量准确度及宽动态范围，尤其适用于复杂生物基质中代谢物的无偏检测和定性鉴定。
母乳代谢组学的现有研究在多个方面面临技术挑战。其中样本前处理和色谱分离是优化化合物检测和提高代谢组覆盖率的两个重要方面。由于母乳基质复杂，涵盖极性和非极性代谢物，且结构多样性和浓度差异大。前处理方法对代谢物提取效率及后续分析的影响显著。传统的双相提取方法（如Folch或Bligh-Dyer方法）利用氯仿-甲醇体系实现代谢物分层提取，覆盖较广，但存在操作繁琐、有机溶剂用量大、毒性高等问题。相较之下，基于甲基叔丁基醚（MTBE）的单相提取法更简便，可以在温和条件下同时提取极性和非极性代谢物，提供了较高的代谢组覆盖率，有显著的优势，但它不能捕获极性的代谢物，如母乳低聚糖、氨基酸和糖类。此外，蛋白质沉淀法作为一种操作简单、成本低的处理方式，通过高效去除蛋白以降低基质效应，可用于气相色谱-质谱或液相色谱-质谱分析极性及疏水性代谢物，但其覆盖率不足，不能同时检测高丰度和低丰度代谢物。综上，不同前处理方法各有其优缺点，且在提取效率、代谢物种类及重现性方面存在差异，需结合研究目的和后续平台进行优化选择。
在色谱分离方面，常用的反相液相色谱（RPLC）适用于中性至疏水性化合物的分离，但对极性代谢物保留能力有限，亲水作用液相色谱（HILIC）通过保留极性代谢物（如氨基酸、糖类等）为RPLC提供互补信息。将RPLC与HILIC联用，并结合质谱分析，有助于提升代谢物的鉴定数量，扩展代谢物的覆盖范围，提升代谢组学研究的全面性和灵敏度。
北京三元食品股份有限公司的景萌娜、付婕妤、陈历俊*等人的研究旨在建立一种高通量、高覆盖率的母乳非靶向代谢组学分析方法。基于UPLC-QTOF-MS平台，通过蛋白沉淀浓缩并优化复溶液，建立适合不同阶段的母乳样本的非靶向代谢组学分析方法，并系统比较其与单相提取和双相提取法在母乳代谢物提取效率和覆盖率方面的差异。同时联合使用RPLC与HILIC两种色谱，以最大程度兼顾极性和非极性代谢物的分离，从而扩展代谢组的覆盖率。通过优化前处理方法与双色谱联合策略两方面，在复杂的母乳基质中实现更高效的代谢物提取和更广泛的检测覆盖率，以期为深入解析母乳成分、评价母乳质量及推动婴幼儿营养研究提供重要的技术支撑和方法学基础。


01
前处理方法相关结果
1.1 总离子流图

选择PPT组做仪器重复性验证，混合母乳样本经过前处理后，分别使用T3和HILIC色谱柱在正、负离子模式下进行检测，PPT组的总离子流图（图1A、B）与3组PCA结果（图1C、D）显示，在正、负离子模式下，两根色谱柱的采集过程稳定，信号重复性良好。














1.2 蛋白沉淀法复溶液对比结果分析
对1个月内（记为1MR）、2个月内（记为2MR）及不同阶段（记为7MR）的混合母乳样本，经过蛋白沉淀法处理后，分别采用两种复溶体系进行处理：复溶液A为甲醇-MTBE-水（2∶1∶1，V/V），复溶液B为甲醇∶二氯甲烷-水（2∶1∶1，V/V）。加入复溶液B混匀后离心，在部分脂肪含量较高的样本中（如1个月内母乳）出现分层，仅能取上层清液进样；而使用复溶液A处理后离心，未出现分层，可直接取上清液进样。为获得更全面的代谢物信息，最终选用复溶液A。
考虑到复溶液复溶液A中MTBE挥发性较强，本研究进一步引入复溶液C体系作为替代方案，复溶液C为异丙醇-甲醇-乙腈-水（2∶1∶1∶1，V/V），并以相同混合母乳样本对复溶液A（记为MTBE组）与C（记为IPA组）的效果进行比较。针对1个月内、2个月内及不同阶段的混合母乳样本分别开展3组平行对比实验，结果显示，两种体系复溶后离心所得上清液均澄清透明，可直接进样，PCA（图2）显示两种复溶液结果聚集在一起，没有明显地分开，说明代谢物检测差异较小，均能满足分析要求。


02
前处理方法对代谢物鉴定的影响
将3种前处理的T3与HILIC色谱柱的数据合并后，系统比较了它们在代谢物种类、化学分类、脂质与非脂质物质的识别能力方面的表现以及3种方法的差异。
2.1 对代谢物的数量的影响
在正离子模式下，PPT组共鉴定到2 738种代谢物，在3种方法中检出数量最多；在负离子模式下，MTBE组共鉴定到1 492种代谢物，在3种方法中数量最多。经正负离子模式数据合并去重后，PPT组共鉴定到3 883种代谢物，整体覆盖数量优于其余两种方法（图3）。这一结果表明，不同前处理方法在代谢物检出能力上存在一定差异，但总体差异程度较小，3种方法均能满足代谢组学的数据分析。相比之下，Holmes等在31位健康母亲的母乳中检测到731种代谢物，而本研究3种方法所得代谢物数量均约为其5倍，表明所建立的方法在代谢物提取效率上具有明显优势。


2.2 对代谢物的化学分类归属影响
进一步统计了各组检测到的代谢物化学分类，结果显示，PPT组鉴定到的代谢物数量最多，有3 883种，其中脂质和类脂质分子为2 206种，各组内脂质和类脂质分子占比均超过50%（表1）。母乳中的脂质是其最重要的成分之一，约占总成分的2%～5%，不仅为婴儿提供超过一半的能量，还具有多种生物功能。由于母乳脂质种类繁多、含量差异大，检测难度较高，理想的检测方法应该既能覆盖高丰度的甘油三酯，也能检出低丰度但功能重要的极性脂质，如磷脂和鞘脂。


为比较3种前处理方法在脂质检测方面的表现，本研究进一步分析了脂质和类脂质分子的化合物类型（图4）。共鉴定出8大类，包括甘油磷脂类、脂肪酰类、甘油脂类、鞘脂类、孕烯醇酮脂类、类固醇及类固醇衍生物、内源性大麻素、糖脂类，这些类别涵盖了母乳中主要且功能重要的脂质成分，同时包含高丰度和低丰度脂质。


不同前处理方法的比较结果显示，PPT组在8类脂质中各类的检测数量均高于MTBE组，脂质覆盖更全面。Lipidout组由于在双相提取后去除了有机相，理论上会导致非极性代谢物（如脂质）的损失，为此，本研究进一步统计了其脂质种类差异，并对数量较多的20个脂质种类别进行比较，种类上包含了Jiang Chenyu等在母乳中鉴定和定量的11个脂质类别。
数量上，PPT组在大多数脂质类别中检出覆盖率更广（图5），而在与Lipidout组的比较中，鞘磷脂（SM）和三酰甘油（TG）的检出水平在Lipidout组更高。SM属于极性磷脂类，主要分布于双相提取的上层极性相，因此在Lipidout组中检出较多。尽管TG为高度疏水性的中性脂质，但其构象灵活性使其与水/有机界面暂时相互作用，可在一定条件下与水和甲醇相互溶解，由于Lipidout组上层溶液含有甲醇和水，且TG具有较高响应值和离子化效率，即使在低丰度下也容易被检测到。在神经酰胺（Cer）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、心磷脂（CL）、单酰甘油（MG）、二酰甘油（DG）以及脂肪酰羟基脂肪酸（FAFAH）的脂质类别中，PPT组的检出数量均高于Lipidout组，值得注意的是，尽管Cer、PE、PC、LPE、CL均为极性脂质，但其在PPT组中的检出水平依然更高，表明该方法在脂质谱的全面覆盖方面具有明显优势。整体而言，PPT组在脂质检出能力上表现最为全面，然而，当研究重点聚焦于非极性脂质时，单相提取或双相提取（有机相）方法可能更为适用。综上所述，本研究结果显示PPT方法在母乳脂质的检出方面，无论在种类覆盖还是数量水平上，均具有更高的覆盖率和更强的检测全面性。


母乳中的低聚糖、氨基酸和糖类是婴儿的生长发育中必不可少的重要成分。尽管单相提取方法在总体代谢组覆盖率上表现较好，但已有研究表明，其对母乳低聚糖、氨基酸、糖类及其他极性代谢物的捕获能力有限。基于此本研究对PPT组与MTBE组中除脂质和类脂质分子以外的化合物的子类和化合物种类进行了统计分析。结果显示，PPT组共检出229种化合物子类，MTBE组为216种。在代谢物数量大于8种的化合物子类中（图6），中链羟酸及其衍生物、二羧酸及其衍生物、黄酮、苯乙胺等在MTBE组中几乎未检出，而PPT组的种类更为丰富。


其中氨基酸和糖类化合物的数量较多。PPT组与MTBE组均检测到包括谷氨酸、L-谷氨酰胺、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、L-苯丙氨酸、缬氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、D-天冬氨酸、L-脯氨酸等80种氨基酸及其衍生物；PPT组中检出单糖50种（如α-D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-果糖）、二糖15种（如乳糖、蔗糖）、多糖4种（如麦芽三糖、D-纤维三糖）以及低聚糖30多种，包括乳糖-N-新四糖、2’-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖，包含常见的母乳低聚糖。MTBE组检出48种单糖、12种二糖、6种多糖、30种低聚糖。两组内共同检出62种糖类，其中PPT组特有41种，MTBE组特有23种，两组组成相似，但MTBE种类略少。
值得注意的是，本研究中MTBE组对氨基酸和糖类的检出较为理想，未出现Andreas等提出的单相提取方法对母乳低聚糖、氨基酸、糖类及其他极性代谢物的捕获能力有限的情况。可能与本研究在检测中同时采用HILIC色谱柱有关，相较于T3柱，HILIC色谱柱更适合母乳低聚糖、氨基酸等物质的检测，所以本研究中采用单相提取方法后同时使用两根色谱柱，增强了对糖类和氨基酸等极性代谢物的保留能力。
综上所述，基于蛋白沉淀法的PPT组在代谢物检测中表现出更高的覆盖率，各类化合物的检出均较为全面，且操作流程简便，可实现高通量批量分析。
2.3 3种前处理的差异分析
在T3和HILIC两种色谱柱采集的3组样本中共鉴定到4 796种代谢物。对这6组数据进行PCA（图7a），结果显示3组T3和3组HILIC明显分离，反映了两种色谱柱在化合物检测特性上的差异；在3组T3中，PPT组与MTBE组聚类位置相近，而与Lipidout组的距离较远。进一步的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）（图7b）显示出与PCA相同的总趋势，但各组间分离度更高。基于PLS-DA结果筛选变量投影重要性值＞1且P＜0.05的差异代谢物，共获得1 265个；选取其中差异最显著的前50代谢物分别绘制T3和HILIC的热图（图7c、d）。从样本聚类结果看，PPT组和MTBE组依然更接近，而与Lipidout组差异较大，这与PCA结果一致。该现象可能与Lipidout组仅取上层清液进行检测有关，使其检测结果更偏向极性化合物，而PPT组与MTBE组无偏向性，从而呈现更高的相似性。










在T3色谱柱上，3组样本的主要差异代谢物（前50）均以脂质和类脂质分子为主，包括甘油磷脂、甘油脂、脂肪酸、鞘脂类，并可分为3个聚类簇。第1簇中，PPT组含量较高，主要包括磷脂酰丝氨酸（22:0/14:1）、PE（19:1/17:2）等甘油磷脂，DG（18:2/22:6）、DG（16:1/20:3/0:0）等甘油脂以及Cer（d20:1/LTE4）；第2簇中，MTBE组含量较高，主要为脂肪酸（22:5）、9,12-十八碳二炔酸等脂肪酸、溶血磷脂酰胆碱（0:0/16:0）、PE（P-16:0/18:2）等甘油磷脂，MG（i-16:0/0:0/0:0）等甘油脂以及Cer（14:3;2O/21:1;(3OH)）；第3簇中，Lipidout组含量较高，其中磷脂酰肌醇（18:0）、SM（d18:1/16:0）、Cer（d18:0/22:6-OH(7)）、辅酶Q6等7个代谢物含量明显高于其他两组。其含量优势可能与这些化合物的两性特征（极性头部和非极性尾部）有关，使其更易溶解于甲醇和水等极性溶剂中。
在HILIC色谱柱上，3组的主要差异代谢物前50除大部分的脂质和类脂质分子外，还包括部分含氧化合物和有机杂环化合物，同样可分为3个聚类簇。第1簇中，Lipidout组含量较高，主要为寡糖Le-X三糖等糖链类化合物、N-乙酰谷氨酸、乳糖胺、胞嘧啶等，这些化合物具有较强极性，因此更易溶于甲醇和水等极性溶剂；第2簇中，MTBE组和PPT组的含量高于Lipidout组，大部分为脂质和类脂质分子，可能与Lipidout组在提取过程中丢失部分非极性脂质有关；第3簇中，PPT组的含量明显高于其他两组，主要成分仍为脂质和类脂质分子。两张热图的结果显示，在3组前处理方法中，蛋白沉淀法在代谢物检测覆盖率上相对更为全面。
综上所述，与其他前处理方法相比，蛋白沉淀结合浓缩前处理具有覆盖全面、提取高效且操作简便的优势。相比之下，双相提取若仅检测上层水相，会造成非极性代谢物的丢失，从而导致代谢物鉴定数量和覆盖率均低于蛋白沉淀法；单相提取虽操作简便，但其提取效率和代谢物覆盖率同样不及蛋白沉淀法。
03
色谱柱类型对代谢物鉴定的影响
母乳是一种复杂的生物基质，既含有母乳低聚糖、氨基酸、核苷及核苷酸等高极性小分子，也包含TG等高度疏水性的脂质类化合物。由于不同代谢物在极性与理化性质上差异显著，单一色谱方法往往难以实现全面覆盖。因此，本研究在不同前处理方法下联合使用T3色谱柱和HILIC色谱柱，以在同一实验中同时检测非极性和极性代谢物，从而更全面地表征母乳的代谢特征。
T3色谱柱主要依赖疏水相互作用，适合分离中低极性代谢物，如脂质类、疏水性有机酸和中性分子，在脂质分离方面表现突出。相较之下，HILIC色谱柱依赖极性相互作用，更适合分离高极性代谢物，包括氨基酸、核苷酸、有机酸和糖类，但对低极性分子保留有限，从而弥补了T3在极性代谢物检测上的不足。以下将结合代谢物鉴定数量、化学分类分布及T3与HILIC组间差异分析，进一步阐述两根色谱柱在母乳代谢物检测中的互补性。
3.1 代谢物的鉴定数量与化学分类归属统计

使用ME软件对母乳样本在T3色谱柱和HILIC色谱柱上采集的数据进行差异代谢物鉴定与分析。将正离子模式与负离子模式数据合并去重后，T3色谱柱共鉴定到4 593种代谢物，HILIC色谱柱共鉴定到1 711种代谢物。所有鉴定代谢物均依据其化学分类信息进行统计，并汇总了两根色谱柱各自的代谢物数量及HILIC对T3检测结果的补充情况（表2，仅显示个数＞15的类别）。


在T3和HILIC色谱柱上检测到的代谢物中，一级分类均以脂质和类脂质分子占比最高，T3色谱柱检出2 762种，HILIC色谱柱检出786种，其中有529种仅在HILIC色谱柱上检出，表明HILIC色谱柱在脂质和类脂质分子检测中具有补充作用。除脂质外，两种色谱柱的检出差异还体现在有机酸及其衍生物、有机杂环化合物、有机含氧化合物、苯并类化合物、苯丙酮和多酮类化合物等类别上。这一结果与Naser等的研究一致，其使用47个均匀跨越半极性和非极性范围的标准品，测试发现不同色谱柱检测代谢物类别上的显著差异。
3.2 组间差异分析
对T3色谱柱和HILIC色谱柱鉴定的代谢物绘制Venn图（图8a），两种色谱柱共识别到了5 830种代谢物，其中有427种代谢物在两种色谱柱上均检出，4 130种仅在T3色谱柱上检出，1 273种仅在HILIC色谱柱上检出。结果表明，所有代谢物中以T3色谱柱检出为主，约占78.16%，两种色谱柱上共同检出的7.32%，HILIC色谱柱单独检出21.84%，约为T3检出数量到的1/3，HILIC能为T3提供显著的补充信息。黄燕等在研究中采用HILIC和RPLC两根色谱柱对14种代表性的代谢物（包括有机酸、氨基酸、胆碱和溶血磷脂等）进行了分析，表明HILIC/RPLC-MS/MS双模式交替分离系统覆盖的代谢物数量更多。Contrepois等优化色谱策略，联合使用HILIC与RPLC方法极大扩展了代谢组的覆盖范围，与单一RPLC相比，在尿液和血浆中极大提升了占比。因此，为获得更全面的代谢物谱，建议在样本采集中同时采用T3与HILIC色谱柱。








为直观比较两种色谱柱的检测差异，对其鉴定的代谢物进行PCA（图8b）。结果显示，相同样本在两种色谱柱上的代谢物分布存在明显差异，T3组和HILIC组内均表现出较高的聚集性，且两组之间分离度明显。这表明HILIC色谱柱能够检出T3色谱柱未能识别的代谢物，该发现与Naser和Zhang Tong等的研究结果一致，即单一的RPLC方法不足以覆盖大量中等极性和低极性的代谢物，需采用互补的组合策略以扩大检测覆盖率。
此外，将两种色谱柱鉴定的所有代谢物进行热图聚类分析（图8c），选取差异最显著的前50种代谢物进行展示。热图颜色梯度（蓝色到红色）直观反映了不同组之间的相对丰度差异。结果显示，两种色谱柱在代谢物丰度分布上存在显著差异，可分为两大簇：第一簇为在T3色谱柱上丰度明显高于HILIC的代谢物，包括PC（25:3）、L-赖氨酸、D-谷氨酸、神经节苷脂GM3（d18:1/12:0）等；第二簇则为在HILIC色谱柱上丰度明显高于T3的代谢物，包括Cer（d18:0/18:0）、胆碱、(S)-肉碱等。上述结果表明，两种色谱策略在不同类型代谢物的保留与检测上具有互补性，联合使用可显著提升代谢物覆盖率并减少检测偏倚。
3.3 通路富集分析
为深入探讨差异代谢物在代谢通路中的功能和作用，本研究基于KEGG数据库进行了通路拓扑结构分析和富集分析。拓扑结构分析采用相对介数中心性方法，评估差异代谢物在通路网络中的重要性。富集分析则利用超几何分布检验，评估差异代谢物在特定通路中的富集程度。
对筛选得到的597种差异代谢物行KEGG注释，其中164种具有KEGG ID。富集分析结果显示，90种代谢物定位于38条代谢通路，其中Impact值＞0.05的通路有18条（表3）。


通路富集结果如图9所示，圆圈的大小和颜色深浅分别代谢差异程度和显著性水平。分析结果表明，T3色谱柱和HILIC色谱柱的差异代谢物主要集中在甘油磷脂代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、半乳糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等18条通路，这些通路在实验条件下的代谢物变化具有重要的生物学意义。其中甘油磷脂代谢位于图的右上角，且点的面积较大、颜色呈红色，表明其在本研究中具有较高影响力与显著性。结果提示，不同类型的色谱柱在代谢物检测上具有互补性，可共同揭示更完整的代谢网络。这一结论与Iturrospe等的研究一致，其通过优化的HILIC-MS方法，实现了近100%极性标准代谢物的分离与检测，覆盖了人类极性代谢组的关键代谢途径，从而确保关键分子不被遗漏。


04
结 论
本研究基于UPLC-QTOF-MS平台，建立了一种高效、灵敏且覆盖率广的母乳非靶向代谢组学分析流程。该方法结合蛋白沉淀浓缩、优化复溶液组成，并联合使用T3色谱柱与HILIC色谱柱，实现了极性与非极性代谢物的互补检测，共鉴定5 830种代谢物，显著提升了检测深度和覆盖范围。3种前处理对比方法结果显示，PPT前处理在代谢物覆盖率和脂质检出方面表现最佳，双色谱策略有效克服了单一色谱的局限性，尤其在甘油磷脂代谢等关键通路信息获取上具有明显优势。综上，本方法通过前处理方法优化，并采用双色谱策略，为构建高覆盖率的母乳代谢物图谱提供了可靠的技术支持，并为母乳营养研究及婴儿健康评估奠定了重要基础。
通信作者：


陈历俊，教授级高级工程司，博士生导师，国际食品科学院院士，北京三元食品股份有限公司首席科学家、国家母婴乳品健康工程技术研究中心主任、中国食品科学技术学会常务理事。
主要研究方向为乳品安全与健康。入选中央组织部“万人计划”、国家科技部科技创新领军人才、国家人社部百千万人才工程突出贡献青年专家、北京学者、科技北京百名领军人才等，被授予国务院政府特殊津贴专家、中国杰出质量人、中国杰出工程师奖、全国劳模、北京市劳模与首都劳动奖章等30余项荣誉称号。
主持/参与863计划等国家级科研课题21 项、市部级科研课题85 项，核心成果获国家科技进步二等奖2 项、北京市等省部级科技进步奖21 项，授权发明专利109 项，制修订国标84 项，发表论文238 篇，出版论著19 部。
引文格式：
景萌娜, 付婕妤, 赵军英, 等. 基于UPLC-QTOF-MS技术的母乳非靶向代谢组学分析方法的建立与优化[J]. 食品科学, 2026, 47(3): 210-221. DOI:0.7506/spkx1002-6630-20250814-103.
JING Mengna, FU Jieyu, ZHAO Junying, et al. Establishment and optimization of an untargeted metabolomics method for the analysis of breast milk based on ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Food Science, 2026, 47(3): 210-221. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250814-103.
实习编辑：陈师昀；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网


为系统提升我国食品营养与安全的科技创新策源能力，加速科技成果向现实生产力转化，推动食品产业向绿色化、智能化、高端化转型升级，由北京食品科学研究院、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，合肥工业大学、安徽省食品行业协会、安徽大学、合肥大学、合肥师范学院、北京工商大学、中国科技大学附属第一医院临床营养科、安徽粮食工程职业学院、皖西学院、滁州学院、蚌埠学院共同主办的“ 第六届食品科学与人类健康国际研讨会 ”，将于  2026年8月15-16日（8月14日全天报到） 在 中国 安徽 合肥 召开。
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